X-Clarity systém na přípravu tkání pro mikroskopii

X-Clarity - polymerizační jednotka, elektroforézní cela a řídící jendotka s chlazením 

Jak funguje X-Clarity?

Oproti studiu jednotlivých buněk je mikroskopické studium orgánů náročnější kvůli tloušťce vzorku a jejich neprůhlednosti. Za neprůhlednost je zodpovědná zejména fosfolipidová buněčná membrána, která kvůli rozdílnému indexu lomu od okolního vodního prostředí způsobuje rozptyl světla. Druhou komplikaci, kterou membrána způsobuje je její neprostupnost pro fluorescentně označené molekuly- protilátky či nukleové kyseliny pro imunoznačení respektive in-situ hybridizaci.

Pro přípravu orgánů je nejprve třeba zbavit organismus, napříklald aboratorní myš, krve perfuzí s PBS. Po vymytí krevních komponentů se tkáň po dobu 24h fixuje 4% roztokem PFA při teplotě 4oC. Formaldehyd zafixuje proteiny umožní jejich navázání na polyakrylamidovou hydrogelovou mřížku, která se vytvoří v následujícím kroku.  V přístroji X-Clarity se nejprve vzorek tkáně napustí monomerem akrylamidu, který posléze polymerizuje ve vakuovém inkubátoru za 37oC  bez přístupu kyslíku, který by proces inhiboval.  (Ukázka videa dole)

V dalším kroku se vzorek tkáně umístí do kazety vhodné velikosti, která umožní kontinuální promývání vzorků roztokem SDS a tok proudu při elektroforéze. Kazeta se vzorkem se vloží do cely, ve které je udržována konstantní teplota, aby se zabránilo poškození vzorku.

Ukázka orgánu v různých stádiích přípravy. Před a po elektroforéze a po ekvilibraci s roztokem s kompatibilním indexem lomu.

Právě proces elektroforézy, byl nejkritičtější a nejvíce komplikovaný krok na optimalizaci během Diessenrothova experimentu. Díky optimalizovanému promývacímu pufru pro X-Clarity se o tento krok nemusíte obávat. Kontrolní jednotka se stará o pumpování pufru i dodatečné chlazení a kontrolu proudu a napětí. Molekuly SDS tvoří v kapalině micely, které šetrně zachycují lipidy a nefixované proteiny, a ty jsou vlivem elektrického pole transportovány skrz vzorek a odnášeny v toku elektrolytu. V závislosti na velikosti a typu vzorku trvá jeho promývání od 2 hodin jako v případě myšího střeva až po 20h v případě celého myšího srdce.  

Záznam průběhu experimentu s konstatntí hodnotou proudu.   

Po promytí se vzorek promyje PBS  a je připraven k imunoznačení  a posléze ustavení indexu lomu. Jelikož hydrogelová síť a navázané proteiny mají vyšší index lomu než vodní prostředí, pro eliminaci rozptylu světla při přechodu mezi různými prostředími se PBS nahradí kapalinou se stejným indexem lomu tedy 1,46.

X-Clarity II - inovovaná jednotka

V této kapalině je vzorek možné i pozorovat a uchovávat. Vhodné techniky na pozorování 3D struktury vzorku jsou konfokální, dvoufotonová nebo light-sheet mikroskopie.

Pohled do myšího mozku- stěny cév žlutě a ECM červeně

Proč pracovat s X-Clarity?

1. Práce s celým orgánem na rozdíl od tenkých řezů nepoškodí strukturu vzorku
2. Je možní pozorovat celulární uskupení a spoje i na dlouhé vzdálenosti, například u neuronů.
3. Po molekulární fenotypizaci imunoznačením je možné pomoci EF protilátky opět odstranit a proces opakovat s jinými látkami
4. Díky X-Clarity je proces vždy precizně kontrolován a je tak reprodukovatelný